RICERCA DI Borrelia burgdorferi SU CAMPIONI BIOLOGICI UMANI MEDIANTE ESAME COLTURALE E TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE

Laboratorio di Analisi Chimico-Cllniche e di Microbiologia, Ospedale “San Martino” Centro Regionale di riferimento per la diagnostica delle malattie trasmesse da zecche °Malattie Infettive, Ospedale “San Martino” ULSS n. I del Veneto – Belluno

I problemi diagnostici posti dalla Borreliosi di Lyme sono stati affrontati a Belluno fin dai primi anni ”90 sia con tecniche di diagnosi diretta che indiretta, tanto che presso la Divisione di Malattie Infettive dell”Ospedale “San Martino” dal gennaio 1992 all”ottobre 2001 sono stati diagnosticati 536 casi di Malattia di Lyme. In tale periodo erano state prelevate per l”esame microbiologico 313 biopsie da zone di eritema cutaneo, e l”esame colturale aveva portato all”isolamento di 128 ceppi di Borrelia burgdorferi con una percentuale di positività delle prove del 40,89%.

Scopo del lavoro. Il nostro studio si proponeva di verificare l”efficacia diagnostica dell”introduzione delle tecniche di biologia molecolare nello studio dei campioni biologici inviati nel corso del 2001 al Laboratorio dell”Ospedale “San Martino” di Belluno e di comparare i dati ottenuti con tale tecnica con i risultati del tradizionale esame colturale. Tale confronto poteva risultare ancor più significativo dato che nel 2001 era stata decisa la sostituzione del terreno BSKII col Modified Kelly Pettenkofer..

Materiali e metodi. Sono state esaminate con la tecnica della Polymerase Chain Reaction (PCR) 74 campioni inviati per la ricerca di Borrelia burgdorferi. Le 62 biopsie cutanee e i 12 liquidi cefalorachidiani provenivano da pazienti giunti all”osservazione nel corso dell”anno con quadri clinici compatibili con Morbo di Lyme.

Per l”estrazione del DNA sono stati utilizzati il metodo del fenolo/cloroformio per i campioni bioptici, e il metodo rapido di denaturazione termica per i liquidi organici. Gli estratti di DNA sono stati amplificati dapprima con i primer c/c ” specifici per B. burgdorferi sensu lato (Rosa, 1991). I campioni risultati positivi sono stati successivamente tipizzati con i primer MC16, MC25 e MC33 (Misonne, 1998) specie specifici per le borrelie considerate patogene per l”uomo.

Risultati. L”indagine mediante PCR ha consentito di evidenziare la positività per Borrelia burgdorferi di 48 campioni (64,86%), 47 biopsie e 1 liquor. Tale risultato confermava in 44 casi la positività dell”esame colturale (59,45%). Va sottolineato, comunque, che l”uso della tecnica PCR ha evidenziato positività in 4 campioni risultati negativi all”esame colturale.

L”analisi genotipica ha dimostrato la presenza di B. afzelii in 44 campioni (91,66% dei positivi) e in 2 campioni la compresenza di B. afzelii e B. garinii. In nessuno dei campioni esaminati è stata dimostrata B. burgdorferi sensu strictue 2 campioni sono risultati non tipizzabili con i primer in esperimento.

Discussione e conclusioni.Il rendimento diagnostico raggiunto dal nostro laboratorio nella ricerca colturale delle borrelie risulta elevato ed è tra i più alti oggi noti, specie nel caso di biopsie cutanee. Con l”utilizzo del terreno di coltura Modified Kelly Pettenkofer il tasso di positività risulta aumentato significativamente rispetto agli anni precedenti.

L”uso in PCR di primer specifici ha permesso l”individuazione di 4 nuove positività in campioni giudicati negativi all”esame colturale, probabilmente per l”esiguo numero di microrganismi presenti. Per quanto attiene all”indagine genotipica è noto che i dati della letteratura suggeriscono una correlazione tra genospecie e forma clinica. L”elevata prevalenza di B. afzelii, che conferma i dati da noi in precedenza ottenuti a Belluno, può essere collegata alle sue note caratteristiche di dermotropismo. Nel liquor è segnalata come di più frequente isolamento B. garinii. Sono queste le due genospecie predominanti nel contesto europeo.

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