LA RICERCA DI Borrelia burgdorferi IN Ixodes ricinus

Materiali e Metodi 

Pur disponendo di numerosi lavori relativi ai metodi di ricerca di Borrelia burgdorferi nelle zecche le indagini di laboratorio trovano ancora diversità di applicazioni. Per la mancanza di standardizzazione delle tecniche di ricerca non si è, infatti, ancora raggiunta una omogeneità metodologica nella dimostrazione diretta della presenza di Borrelia burgdorferi.

La ricerca diretta si basa sulla dimostrazione microscopica e/o sull’isolamento e l’identificazione delle spirochete; attulamente si sta affermando sempre di più l”uso di tecniche di biologia molecolare per la rilevazione del genoma batterico o di antigeni batterici.
Per quanto attiene all”esame microscopico, le tecniche di impregnazione argentica, come la colorazione di Warthin-Starry, che permettono di visualizzare Borrelia in sezioni tissutali, si sono dimostrate poco specifiche.
Al contrario le colorazioni immunochimiche, che prevedono l’uso di anticorpi monoclonali, presentano una buona specificità. Le spirochete possono essere evidenziate anche con osservazioni di preparati, per esempio di sangue o liquor, dopo colorazione con arancio di acridina e con Giemsa.

La sensibilità della microscopia in campo oscuro non si è rivelata soddisfacente. Gustafson ha dimostrato la presenza di spirochete solo nel 7% delle zecche esaminate (Gustafson 1989).
Le difficoltà che si incontrano nell”allestimento delle prove colturali hanno limitato il ricorso a tali metodi. Le spirochete richiedono, tra l’altro, terreni complessi, costosi e delicati.
Già dal 1984 Barbour aveva dimostrato che tutte le specie crescono abbastanza bene nel tuorlo d’uovo embrionato di gallina (Barbour 1984). Questa tecnica è, però, riservata ai centri specializzati.
Tra i terreni di coltura utilizzati può essere citato quello di artificiale di Kelly che permette l”isolamento di alcune specie (Kelly 1971).
Comunemente si utilizza il terreno liquido modificato di Barbour-Stonner-Kelly (BSK II medium), molto ricco in aminoacidi, vitamine, N-acetilglucosamina, gelatina, albumina bovina e siero di coniglio. Le spirochete crescono a pH neutro e incubate in ambiente microaerofilo a 30-37°C per lunghi periodi (i campioni clinici sono incubati per un mese, e settimanalmente si allestiscono subcolture). Le colture di Borrelia possono essere conservate per molti anni a -70°C in un terreno contenente glicerolo al 10-20% (Schwann et al. 1995). E’ stato dimostrato che le borrelie necessitano di lipidi come fattori di crescita. Inoltre lo sviluppo di questi microrganismi si è rivelato lento: presentano un tempo medio di divisione di 16-18 ore, mostrando una crescita visibile dopo almeno 6-7 giorni di incubazione (Cinco 1998).

Molte sono le difficoltà che si incontrano nell”allestimento delle colture di zecche. L”esame colturale risulta indaginoso per la presenza di microrganismi contaminanti che non sempre vengono inibiti dall’aggiunta di antibiotici al terreno. L”esame, inoltre, richiede molto tempo, tanto che possono essere necessarie alcune settimane per giungere ad un risultato valido (Gustafson1989).

Recentemente alcuni autori hanno descritto l’isolamento delle borrelie da campioni clinici utilizzando linee di fibroblasti murini (L-929) (Tylewska-Wierzbanowska 1997). La moltiplicazione del microrganismo provoca un effetto citopatico caratteristico con comparsa di fibroblasti giganti vacuolizzati. L’uso di anticorpi monoclonali marcati con fluorocromi ha permesso di evidenziare i microrganismi sia liberi nel liquido di coltura che nelle cellule. Questa tecnica viene, pertanto, ritenuta molto sensibile e specifica.
I metodi di biologia molecolare (sonde geniche e PCR) stanno trovando sempre maggior applicazione sia nel campo della ricerca pura che nella diagnostica. Nell”ambito delle indagini sulle zecche questi metodi vengono ormai impiegate routinariamente.
Attualmente sono note diverse sequenze genomiche, cromosomiali e plasmidiche, specifiche per le varie specie di Borrelia. Numerose, infatti, sono le coppie di primer saggiate : per il gene OspA, per il gene della proteina p66, per i geni degli rRNA 16S e 23S, per il gene fla, ecc. (Cinco et al 1994) (Fukunaga N. et al. 1996) (Liebisch G. et al. 1998) (Mateika F. et al. 1997) (Misonne and Hoet 1998) (Misonne et al 1998) (Priem et al. 1997) (Rosa and Schwan 1989) (Rosa et al 1991) (Schmidt 1997).

La PCR (Reazione Polimerasica a Catena) consente l’amplificazione di differenti regioni del DNA di Borrelia burgdorferi. Il metodo, anche se altamente specifico, ha però dei limiti: scarsa sensibilità, insoddisfacente standardizzazione e impossibilità di individuare le fasi dell’infezione (Grignolo M.C. et al.2000).
Diversi autori hanno descritto metodi di rilevazione di antigeni specifici di B. burgdorferi nei liquidi biologici, tra i quali le urine (Schmidt et al. 1997).
La sensibilità dalle tecniche IFA e PCR nella ricerca di Borrelia burgdorferi nelle zecche è stata studiata da vari autori (Kahl et al 1998).
L’IFA è più economico, meno sofisticato e, a parte il microscopio a fluorescenza, non sono necessari strumenti particolari; i risultati della lettura sono però soggettivi e dipendono dall’esperienza dell’operatore; anche se è possibile distinguere le diverse genospecie di Borrelia utilizzando diversi anticorpi monoclonali. Questa tecnica risulta poco pratica se si hanno molti campioni da analizzare (problema che la PCR ha largamente risolto). La PCR, infatti, non solo si è dimostrata molto sensibile, ma è anche in grado di distinguere facilmente le diverse genospecie presenti in ogni singola zecca. Ci sono però degli svantaggi anche in questo metodo: è stato dimostrato che, nelle zecche ingorgate di sangue, si ha una massiccia inibizione della reazione di amplificazione con inevitabili errori di valutazione del grado di infezione (Schwartz et al.1997). Tra i nodi da risolvere si possono citare il rischio di contaminazioni con DNA estraneo, le problematiche sulla qualità dei primer, ecc.. Le zecche utilizzate per la PCR possono essere conservate per lungo tempo prima dell’analisi, mentre per l”IFA i campioni possono essere conservati per lungo tempo solo dopo essere stati processati. L”IFA può fornire risultati quantitativi sul grado di infezione, possibilità che non è ancora standardizzata per la PCR. Altri metodi quantitativi per rilevare il grado di infezione sono la microscopia in campo oscuro e a contrasto di fase (anche se meno sensibili dell’IFA), e la ricerca delle proteine di superficie mediante ELISA.

Per la determinazione di specie di Borrelia burgdorferi sono stati descritti diversi metodi: PCR con primer specifici per ogni gruppo genomico, analisi dei prodotti di amplificazione mediante sequenziamento del DNA, analisi RFLP (Polimorfismo dei Frammenti di Restrizione), e RLB (Reverse Line Blotting). Questo si basa sull’ibridizzazione dei prodotti di PCR con sonde specifiche immobilizzate su una membrana, e usa come bersaglio regioni spaziatrici intergeniche tra i geni 5S e 23S rRNA (Rijpkema et al. 1995). Tale sistema inoltre non richiede sequenziamento di prodotti di PCR per assicurare la tipizzazione di piccole quantità di prodotto di amplificazione, e offre la possibilità di rilevare contemporaneamente diversi gruppi genomici, nonché di evidenziare coinfezioni di diversi tipi di Borrelia

Alla luce di quanto esposto sui metodi di ricerca di Borrelia burgdorferi, nell’ambito dello studio di incidenza di infezione in Ixodes ricinus, si è preferito utilizzare l’amplificazione, tramite PCR, del DNA estratto da tali parassiti.

Nelle nostre indagini, gli esemplari di Ixodes ricinus, pervenuti in laboratorio, sono stati conservati a 4°C immersi in alcool etilico 70% fino al momento dell’analisi.
Sono stati usati due diversi metodi di estrazione in rapporto al tipo di campione in esame: per le zecche adulte, più grosse e dure, si è preferito usare il metodo della digestione con proteinasi K e successiva estrazione con fenolo/cloroformio (Sambrook 1981); per le ninfe e le larve, più piccole e meno dure, si è utilizzato il metodo di estrazione con idrossido di ammonio 0.7 M (Schouls et al. 1999).

Estrazione con tampone di lisi e fenolo/cloroformio: le zecche, precedentemente frantumate nella provetta con un puntale, venivano lasciate una notte in termoagitatore a 56 °C con 300 ml di tampone di lisi (Tris-HCl 10 mM pH 8, SDS 0.5%, NP40 0.5%, proteinasi K 250 mg/ml). La fase acquosa veniva separata tramite centrifugazione dopo l’aggiunta di un ugual volume di fenolo/cloroformio/alcool isoamilico 25:24:1; una successiva fase di purificazione avveniva con centrifugazione dopo l’aggiunta di un volume pari di cloroformio. La precipitazione del DNA si otteneva aggiungendo alla fase acquosa 1/10 di volume di sodio acetato 3 M pH 5.2 e 1 ml di isopropanolo e 5 ml di RT. I sedimenti, lavati in alcool al 70%, venivano essicati sottovuoto. Il DNA liofilo veniva risospeso con 300 ml di H2O e usato per l’amplificazione. 

Estrazione con idrossido di ammonio: le zecche venivano asciugate all’aria, e bollite per 20 minuti in 100 ml di idrossido di ammonio 0.7 M per liberare il DNA; una volta raffreddate le provette contenenti il lisato venivano messe senza tappo a 90°C per 10 minuti in modo da far evaporare l’ammonio. Il lisato delle zecche così ottenuto veniva usato direttamente per l’amplificazione. Le zecche più grosse (ninfe) venivano precedentemente schiacciate, con un pestello o con un puntale, sul bordo interno della provetta in modo da rompere lo scudo e facilitare la liberazione degli organi interni.Sono sempre stati utilizzati prodotti della ditta Sigma. 

Ciascun estratto è stato amplificato con i primer 16 a/b specifici per sequenze di DNA mitocondriale di Ixodes, come controllo della fase di estrazione e per verificare l’appartenenza alla specie(Stephen et al. 1995) (Matuska). 

Gli estratti di ogni singola zecca, risultati positivi all’amplificazione con i primer 16a/b, sono stati amplificati con la coppia di primer c/c’ (Rosa et al. 1991) che riconoscono una regione del cromosoma di Borrelia burgdorferi sensu lato, altamente conservata in ogni genospecie. Tali primer  sono stati usati con successo per amplificare DNA proveniente da colture cellulari, liquidi biologici di pazienti e zecche infette in grado di rilevare meno di 5 copie genomiche di Borrelia burgdorferi anche in presenza di un grande eccesso di DNA eucariotico (Rosa et al. 1991) (Misonne and Hoet 1998).I primer usati sono stati forniti dalla ditta Experteam. 

SEQUENZA PRIMER 16a/b (Stephen 1995)

16a/b

(530bp)

5’-CGC CTG TTT ATC AAA AAC AT-3’

5’-CTC CGG TTT GAA CTC AGA TC-3’

Mitocondrio 16a/b

SEQUENZA PRIMER C/C’(Misonne and Hoet 1998)

C/C’

(126bp)

5’-CCA ACT TTA TCA AAT TCY GC-3’

5’-AGG ATC TAT TCC AAA ATC-3’

B. burgdorferi sensu alto

In tutte le prove sono stati impiegati controlli multipli, negativi (acqua) e positivi: per c/c’ estratti di ceppi appartenenti alle tre genospecie del complesso sensu lato, per 16a/b estratti di Ixodes ricinus.
Per il protocollo di amplificazione si sono seguite le indicazioni della ditta Perkin Elmer relative al kit “GeneAmp PCR Core Reagents”, adeguandone la concentrazione di MgCl2 in base ai primer usati.

MASTER MIX DI REAZIONE

C/C’

16a/b

Buffer 10X

MgCl2 (1.5mM)

dNTPmix

Primer senso

Primer antisenso

Ampli taq

H2O

Campione

10ml

6ml

16ml

5ml

5ml

0.5ml

52.5ml

5ml

Buffer 10X

MgCl2 (2mM)

DNTPmix

Primer senso

Primer antisenso

Ampli taq

H2O

Campione

10ml

10ml

16ml

5ml

5ml

0.5ml

43.5ml

5ml

Per il processo di amplificazione è stato usato il termociclatore PE 2400 della ditta Perkin Elmer, adattando le temperature di denaturazione e annealing ai relativi primer.

PROGRAMMA DI AMPLIFICAZIONE IN TERMOCICLATORE

C/C’(Misonne)

16a/b(Stephen)

96°C 5’

94°C 5’

96°C 1’

54°C 1’

72°C 1’

X 40 cicli

94°C 30’’

45°C 30’’

72°C 30’’

X 40 cicli

72°C 10’

72°C 10’

I prodotti delle reazioni di amplificazione sono stati evidenziati mediante elettroforesi in gel di agarosio (Nu-Sieve/ Sea-Kem 1:3) al 2.5% in TBE (0.045 M Tris-borato pH 8, 0.001 M EDTA), colorato con etidio bromuro 10 mg/ml diluito 1:10000.
In ogni pozzetto venivano caricati 8 ml di campione più 2 ml di Loading Buffer (glicerolo 25%, TBE 5%, blu di bromocresolo 0.125%).
Come marker di pesi molecolari è stato usato pGEM (Promega), DNA digerito con HinfI, RsaI, SinI, che presenta 15 frammenti compresi tra 2645 e 36 bp, diluito 1:11 in TE (Tris-HCl 10mM, EDTA 1mM).
I risultati, evidenziati su transilluminatore a raggi UV, sono stati tutti documentati con un sisitema fotografico Polaroid a fuoco fisso.
Il DNA liofilo estratto deve essere risospeso in quantità di acqua variabili in rapporto alle dimensioni della zecca, in modo tale da utilizzare concentrazioni di acido nucleico adatte alla buona riuscita della reazione di amplificazione.
Entrambi i metodi adottati per l’estrazione e la purificazione del DNA permettono di eliminare gli inibitori dell’amplificazione presenti nel materiale ematico succhiato dalla zecca.

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